流動(dòng)相
使用水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，水溶液中的細(xì) 菌等微生物容易滋生。當(dāng)使用有機(jī)酸緩沖液的水溶液保護(hù)色譜柱時(shí)，一些霉菌可能會(huì)在色譜柱中滋生并堵塞固定相顆粒之間的間隙。
由于濕填料技術(shù)的出現(xiàn)，常用的的直徑HPLC色譜柱填料一般小于10um，流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)容易先沉積在柱頭上，然后慢慢堵塞柱子。
流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜柱也有影響，特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料。 水溶液的zui佳pH值范圍在2到7.5之間。當(dāng)pH大于8時(shí)，硅膠會(huì)釋放并生成絮凝物堵塞HPLC柱，且難以恢復(fù)，柱效迅速降低，甚至完全失效。
當(dāng)緩沖液中加入甲醇或乙腈等有機(jī)溶劑時(shí)，鹽的溶解度會(huì)降低，鹽會(huì)沉淀并堵塞柱子。同時(shí)，流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽分會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板，造成柱頭下沉。
流動(dòng)相的極性對(duì)色譜柱也有一定的影響。對(duì)于硅膠柱，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質(zhì)會(huì)破壞填料。反之，對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠，正丁醇、二氯甲烷等極性較小的物質(zhì)也起到同樣的作用。堿性溶液會(huì)損壞陽離子交換樹脂色譜柱，而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂色譜柱。
樣品和固定相
如果少量或痕量樣品不能溶解在流動(dòng)相中，它會(huì)在通過固定相時(shí)堵塞色譜柱。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞色譜柱。糖類、蛋白質(zhì)等樣品成分在通過色譜柱時(shí)會(huì)被不可逆吸附，從而覆蓋固定相的活性位點(diǎn)。樣品組分也會(huì)與固定相發(fā)生反應(yīng)，尤其是氨基柱，因?yàn)榘被菀着c酸酐和酮形成席夫縮合，減少了活性位點(diǎn)，縮短了保留時(shí)間。
色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著變化。大多數(shù)鍵合相通過硅-氧-硅鍵（Si-O-Si）與硅基體相連，形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R（R為CnH2n+1）。硅-氧-硅鍵在水溶液中可能因水解而斷裂，導(dǎo)致鍵合基團(tuán)脫落。
