高效液相色譜系統(tǒng)的有效運行取決于流動相和樣品不受化學雜質或固體懸浮液的影響。HPLC流動相處理和使用中的注意事項討論了流動相制備和使用過程中應采取的措施。樣品過濾的重要性討論了清潔樣品進樣的好處。
高效液相色譜柱是高效液相色譜系統(tǒng)的關鍵部件，需要小心處理和保護。經(jīng)常更換色譜柱是很昂貴的，因此您的目標應該是*大限度地延長色譜柱的使用壽命，以便每次都能獲得所需的準確度和一致性結果。
由于雜質和懸浮液的逐漸累積，HPLC柱的色譜行為在使用過程中開始下降。流動相或樣品中大于2μm的顆粒開始沉積在柱的入口玻璃料上，從而干擾流動的均勻性。較小的顆粒會導致背壓增加，因此它們開始阻塞固定相的流動路徑。
污染物的性質
- 反相分離中高度保留的化合物，如脂肪酸
- 不可逆保留的化合物，如殘留的蛋白質，在樣品提取時未完全去除。強烈建議在HPLC分析之前對生物液體中的蛋白質進行脫蛋白處理。
- 顆粒雜質可能是由于樣品未過濾，系統(tǒng)部件（如泵或噴油器中的密封件）磨損而釋放的顆粒。
- 柱內(nèi)殘留緩沖液干燥產(chǎn)生的結晶沉積物。使用后用HPLC級水或緩沖溶液清洗色譜柱可防止此類鹽沉積的形成。
什么是保護柱？
保護柱是安裝在進樣器和分析柱之間的保護柱或小柱。 它用于去除到達分析柱的雜質和懸浮固體。 通常它具有大約 2 厘米的長度和 4.6 毫米的內(nèi)徑。 保護柱填充有約 40 μm 大小的片狀顆粒，壓降可忽略不計。
護柱的理想特性
- 保護柱*好具有與分析柱相同的填料，以消除分離并發(fā)癥
- 護柱的內(nèi)部ID應與分析柱相當，以將背壓降至*低。較短的保護柱長度是可取的，但其長度應足以防止強烈保留的化合物到達主柱
- 面向注入器的熔塊應可移除，以便通過移除約2 mm的材料并填充新材料進行清潔
- 與可重新填充的防護柱相比，一次性盒式防護柱使用方便且經(jīng)濟。
需要定期更換保護柱，但通過觀察色譜行為的變化，如背壓增加、峰加寬和峰保留時間的變化，需要進行中間更換。然而，變化頻率可根據(jù)樣品的化學成分、高保留或不可逆保留成分的存在、進樣量或進樣次數(shù)來確定。
