[色譜柱的使用]實(shí)驗(yàn)結(jié)果不重現(xiàn)該怎么辦？

在日常檢測或方法轉(zhuǎn)移過程中，新色譜柱無法重現(xiàn)舊柱的方法，或者不同時(shí)間測試結(jié)果不重現(xiàn)，是困擾分析人員的常見問題之一，具體是什么原因?qū)е碌哪兀?/span>可以從哪些方面進(jìn)行排查？

本文將結(jié)合兩個(gè)實(shí)際案例為大家說明。

實(shí)例分享一

客戶開發(fā)的分析方法，轉(zhuǎn)移到新site后發(fā)現(xiàn)新購買的同一批次3根CORTECS C18新柱都無法重現(xiàn)原方法，但僅第1個(gè)化合物峰形較差，其他峰均無問題，這可能是什么原因？見圖一。

圖一

色譜柱返回沃特世實(shí)驗(yàn)室后，首先復(fù)核色譜柱柱效，3條色譜柱性能均正常，判斷化合物峰形不佳不是色譜柱的質(zhì)量問題。然后按照客戶提供的方法重現(xiàn)樣品分析條件，發(fā)現(xiàn)與客戶反饋的結(jié)果一致，峰1拖尾嚴(yán)重。后期我們在原分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整，如增加甲酸濃度，使用50 mM甲酸銨（pH不變）等，發(fā)現(xiàn)使用緩沖鹽后，峰形明顯改善，但出峰順序改變。見圖二。

圖二

優(yōu)化后的方法（使用50 mM甲酸銨）在不同色譜柱上的重現(xiàn)結(jié)果，見圖三。

圖三

實(shí)例分享二

同一支色譜柱同一個(gè)樣品，在pH耐受性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別雜質(zhì)峰保留時(shí)間不穩(wěn)定，隨pH變化而改變，如圖四所示，說明該雜質(zhì)對pH敏感，為何會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象？我們應(yīng)該如何應(yīng)對？

圖四

我們知道酸/堿性化合物的保留行為受pH影響很大，酸性化合物在低pH的條件下呈分子狀態(tài)，保留較好；而堿性化合物在高pH的條件下呈分子狀態(tài)，保留較好。而當(dāng)流動(dòng)相pH趨于化合物pKa（即非保留平臺(tái)區(qū)）時(shí)，pH變化會(huì)嚴(yán)重影響化合物的保留行為，如圖五所示。

圖五

在方法開發(fā)初期盡量將流動(dòng)相pH設(shè)置在分析物pKa±2以外區(qū)域，若無法避開，pH的精準(zhǔn)控制將非常重要，建議盡量采用稱重法配制流動(dòng)相，以保證不同時(shí)期配制流動(dòng)相測試的可重現(xiàn)性。

綜上，當(dāng)分析方法中使用添加劑或者緩沖鹽的濃度較低時(shí)，可能容易出現(xiàn)新柱結(jié)果不重現(xiàn)的問題，您可以考慮以下Tips~

Tips

? 增加添加劑或者緩沖鹽濃度，或者使用高濃度緩沖鹽老化新色譜柱后再使用。

? 對pH敏感項(xiàng)目如肽藥，需要對pH精準(zhǔn)控制，流動(dòng)相配制可采用稱重法。

? 方法開發(fā)初期盡量多考察不同批次色譜柱，以驗(yàn)證方法的耐用性。

注：本文分享自【沃特世技術(shù)服務(wù)】公眾號(hào)。

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